3AT系统,酵母双杂交实验中的关键抑制剂

3AT系统：酵母双杂交实验中的关键抑制剂

酵母双杂交系统是一种用于研究蛋白质之间相互作用的技术。在实验过程中，为了降低背景表达，常常需要使用抑制剂来抑制非特异性结合。3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）就是这样一种常用的抑制剂，它能够有效地抑制HIS2报告基因的自激活，从而提高实验的准确性和可靠性。

什么是3-AT？

3-AT，全称为3-氨基-1,2,4-三唑，是一种有机化合物，化学式为C3H4N4。它是一种常用的竞争性抑制剂，能够与HIS2报告基因结合，从而抑制其自激活。在酵母双杂交实验中，3-AT的加入有助于降低背景表达，使得实验结果更加准确。

3-AT在酵母双杂交实验中的作用

在酵母双杂交实验中，HIS2报告基因的自激活会导致背景表达过高，从而影响实验结果的准确性。为了解决这个问题，可以在筛选培养基中加入适量的3-AT。3-AT通过与HIS2报告基因结合，抑制其自激活，从而降低背景表达。

此外，3-AT的加入还可以提高实验的特异性，使得只有那些真正发生蛋白质互作的克隆才能在含有3-AT的培养基上生长。这对于筛选出具有真实蛋白质互作关系的克隆至关重要。

3-AT的使用方法

在使用3-AT进行酵母双杂交实验时，需要遵循以下步骤：

计算所需平板的数量，并配置相应的培养基体积。

设置3-AT的浓度梯度，通常建议在10-50 mM的浓度范围内设置3-5个梯度，常用浓度约为30 mM。

灭菌筛选培养基，待培养基冷却到55°C左右，加入3-AT母液，摇匀后倒板。

标记每个平板的3-AT浓度，在超净台冷却凝胶后，按单位面积单个克隆计算培养物浓度，涂板。

在28-30°C的条件下培养3-5天，筛选出最佳3-AT浓度，用于后期互作筛选。

注意事项

在使用3-AT时，需要注意以下几点：

理想情况下，10 mM浓度的3-AT平板应有少量生长，而20 mM浓度的3-AT平板则不能或极少生长。

如果在80 mM浓度的3-AT平板上生长酵母，说明自激活活性太高，不能用于双杂交筛选。

3-AT浓度过高可能会抑制蛋白间比较弱的相互作用，因此需要筛选确定最适浓度。

3-AT作为一种常用的抑制剂，在酵母双杂交实验中发挥着重要作用。通过合理使用3-AT，可以有效降低背景表达，提高实验的准确性和特异性。了解3-AT的使用方法和注意事项，对于进行高质量的酵母双杂交实验至关重要。